Autor: M.C. Manuel Pérez Durán

INTRODUCCIÓN

El procesamiento de semen y el uso de la inseminación artificial (IA) en especies como la bovina y principalmente en la industria lechera es una actividad ampliamente extendida y con buenos resultados biológicos y económicos. Los avances genéticos logrados en las diferentes especies, han obedecido principalmente a los procesos de selección de animales con mérito genético superior y la IA, ha permanecido como el principal vehículo para la diseminación de genes deseables y el consiguiente mejoramiento en la producción.

La IA constituye una técnica que ha permitido el avance acelerado de los programas de reproducción y mejoramiento genético, a la vez ayuda a eliminar ciertas limitantes, por ser una herramienta eficaz que tiene un papel relevante en la planeación y control reproductivo dentro de los sistemas de producción, facilitando la adaptación de dichos sistemas a las exigencias cambiantes del mercado.

En los sistemas de producción, la necesidad de fertilizar grandes números de hembras con semen de animales genéticamente superiores y distantes, por largos períodos, o en diferentes momentos a través del año, estimula la investigación del almacenamiento de espermatozoides bajo condiciones artificiales.

El congelamiento para la conservación del semen y las técnicas que se utilizan, así como los diluyentes deben ser modificadas, por las diferencias que existen entre las especies, ya que la metodología utilizada para el procesamiento de semen bovino, no ha dado resultados satisfactorios en otras especies tales como el caprino, porcino y el equino, debido a que la tasa de recuperación de células viables no es la misma. De modo que, ni las técnicas ni los diluyentes de procesamiento de semen de bovino, pueden ser transferidas en su totalidad a otras especies.

En la actualidad existen técnicas específicas para congelar semen en las diferentes especies, así como distintos medios para diluir el semen que dan calidad satisfactoria en la técnica de IA, sin descartar que también existen factores que contribuyen al éxito en las técnicas de colección y procesamiento de semen, tales como nutrición, instalaciones, proceso de adiestramiento, etc.

Diluyentes

Los diluyentes se definen como sustancias que se adicionan al eyaculado con la finalidad de conservar su metabolismo, fertilidad y viabilidad, lográndose esto al añadir al semen sustancias que sean capaces de funcionar como nutrientes, protectores y amortiguadores de las células espermáticas; además con el uso de los diluyentes también se pretende aumentar el volumen; disminuir el metabolismo espermático y reducir al mínimo las probabilidades de crecimiento microbiano.

Características de un buen diluyente. Los requerimientos para cualquier diluyente son:

Presencia de sustancias iónicas o no iónicas para mantener las osmolaridad y que actúen como amortiguadores (buffer) con la finalidad de prevenir cambios en el pH.

1. Una fuente de lipoproteínas o substancias con alto peso molecular para prevenir el choque térmico, como yema de huevo o leche.
2. Un agente crioprotector como glicerol, dimetil-sulfóxido (DMSO) u otros.
3. Una fuente de energía como glucosa o fructosa.
4. Otros aditivos como antibióticos y antioxidantes.

Amortiguación del pH. Los Buffer se adicionan con la finalidad de neutralizar los productos de desecho del metabolismo espermático, principalmente el ácido láctico. Un diluyente debe ser isotónico al semen (tener la misma concentración de iones libres, debe tener capacidad amortiguadora (evitar cambios en el pH al neutralizar los productos del metabolismo) Un buffer común es el citrato de sodio, aunque también se han usado otros como el Tris (hidroximetil-amino-metano con buenos resultados, proporcionando un pH adecuado (6.5 – 7.2).

Fuentes de energía. El consumo de energía es esencial para el mantenimiento y motilidad del los espermatozoides, estos son capaces de utilizar azucares simples como la glucosa, fructosa y manosa.

Antibióticos. Generalmente los testículos y las glándulas sexuales accesorias se encuentran libres de bacterias, la contaminación bacteriana del semen ocurre al momento de la recolección o de la manipulación del semen con instrumentos del laboratorio, lo que tiene efectos detrimentales en la viabilidad de los espermatozoides por lo que es de vital importancia la adición de antibióticos al diluyente para el semen. Estos se agregan con la finalidad de prevenir la proliferación microbiana, destruir los organismos patógenos o al menos reducir su número, reducir el metabolismo de los espermatozoides y en cierto grado prevenir la diseminación de enfermedades. La combinación de penicilina (1000 UI/ml) y estreptomicina (1 mg/ml) son ingredientes estándares en los diluyentes utilizados para semen de rumiantes.

Composición de los diluyentes más utilizados y su preparación. La preparación de los diluyentes deberá realizarse previamente a la extracción del semen, así como la esterilización de la cristalería que se utilizará.

1. Citrato-Yema

2. Tris-Yema

• 3.8 g de tris (hidroximetil) aminometano p. anal sustancia tampón C12 H11 NO3, PM 121.14 gr/mol.
• 2.1 g de ácido cítrico, monohidratado granular HOC(COOH) (CH2COOH) 2H2O, PM 210.14 gr/mol.
• 20 ml de yema de huevo fresco.
• 1 g de D-fructosa (PM 180.16 gr/mol)
• 1000 UI/ml de penicilina g sódica cristalina
• 1 mg/ml de estreptomicina monaxin

Preparación: Se diluyen perfectamente bien las sustancias químicas en 80 ml de agua desionizada (conductividad 2-3 ppm) y posteriormente se adiciona la yema de huevo y los antibióticos. Se agita la mezcla hasta homogeneizar perfectamente.

3. Leche en polvo

• 10 gr de leche en polvo (1% de grasa)
• 1mg/ml de D-fructosa
• 1000 UI/ml de penicilina g sódica cristalina
• 1 mg/ml de estreptomicina monanxin

Preparación: Se diluye la leche perfectamente bien en 100 ml de agua desionizada (conductividad 2-3 ppm), se coloca en baño María, se calienta a 95°C por 10 min. Se enfría a 30°C y se agregan la fructosa y los antibióticos.

4. Leche entera

Una vez preparado el diluyente se divide en dos partes iguales, una para la predilución y la primera dilución (Diluyente A), y a la otra se le agrega la cantidad correspondiente de glicerol según el diluyente usado (Diluyente B). La cantidad de glicerol (PM 92.1 gr/mol, C3H8O3) que se agrega a los diluyentes en el procesamiento de semen bovino varía de acuerdo al diluyente utilizado, y éste va de 10 a 14%. Cuando se utiliza leche se recomienda el 10%, Tris 12% y Citrato 14%.

Métodos de Recolección de semen

Existen varias formas de recolectar semen y el método que se utilice depende en ciertos casos del propósito final de la recolección. Una muestra para análisis puede ser de volumen tan pequeño y no tan limpia como las utilizadas para la inseminación artificial. En la actualidad se conocen dos técnicas para la recolección de semen en sementales bovinos, la llamada vagina artificial y la estimulación eléctrica o electroeyaculación. Cabe señalar que la rutina para la recolección seminal de esta especie es; tratándose de toros jóvenes se podría colectar una vez por semana y en sementales adultos dos veces por semana; recolectando siempre dos eyaculados seguidos por día.

Vagina Artificial (VA). En la mayoría de las especies el semen utilizado para la inseminación artificial se obtiene por medio de la técnica de VA, es el método de preferencia debido a su rapidez y limpieza en la operación, además de que no es estresante para el animal y el semen recolectado es de mejor calidad. La VA es una imitación de la vagina de la hembra, que proporciona los estímulos térmicos (temperatura) y mecánico (presión) necesarios para la erección y eyaculación.

La VA consiste en una armazón rígida de hule de 40 cm. de largo y 6.4 cm. de diámetro para toros adultos; los toros jóvenes se pueden iniciarse con vaginas de 20 a 24 cm. de largo y 5.1 cm. de diámetro. A esta armazón se le forra con látex de textura rugosa, los extremos terminales de este forro se doblan por fuera de la armazón y se asegura con bandas elásticas. El espacio entre el forro y el armazón se llena con agua caliente para obtener la temperatura y presión adecuada. A un extremo de de la unidad se le adapta un cono látex con un tubo colector graduado. La temperatura más adecuada del agua en el revestimiento interno de la VA es de 43 a 46ºC.

Electroeyaculación (EE). Los primeros intentos por conseguir la electroeyaculación de animales de laboratorio fueron crueles y consistieron en colocar electrodos en el hocico y la nuca de estos, sin embargo, los últimos avances condujeron al desarrollo de electrodos digitales y al estímulo de centros nerviosos específicos, para provocar la eyaculación sin provocar efectos colaterales.

Este método permite la obtención de semen de animales no entrenados al uso de la VA, y aunque el método en manos inexpertas es objetable por la frecuencia con que se obtiene semen de baja calidad, principalmente por contaminación con el interior del prepucio o baja concentración de espermatozoides; en manos de un operador competente es posible obtener semen de buena calidad comparable en todos sentidos con el que se obtiene por medio de VA, aunque constantemente de menor concentración. Aun así, la motilidad, la capacidad de resistir el procesamiento, la congelación y la fertilidad del semen obtenido con ambos métodos es comparable.

La técnica de EE tiene varios inconvenientes como: a) produce malestar en el macho, b) no se pueden hacer variar recolecciones frecuentes, c) es más fácil de que el eyaculado se contamine, d) el semen obtenido es mayor en volumen pero menor en concentración, e) el incremento en el volumen del plasma seminal ocasionado por la estimulación eléctrica reduce la resistencia del espermatozoide al choque por frío y f) decrece la tasa de sobrevivencia del semen congelado.

Existen varios modelos de electroeyaculadores, el aparato contiene un transformador y un reostato para controlar el voltaje que pasa hacia la sonda. En general el aparato posee un apagador, un botón de poder y una conexión para la sonda, dispositivo que se inserta en el recto y posee electrodos dispuestos en sentido longitudinal sobre la superficie. Dichos electrodos se colocan sobre las ámpulas y las glándulas vesiculares, para producir la emisión de esperma desde los conductos deferentes y las propias ámpulas, estimulándose además los centros de erección y eyaculación. Los eventos en respuesta a la electroeyaculación son: Estimulación del plexo nervioso sacral y músculos del tren posterior, goteo de fluido seminal claro de la vaina, erección del pene en la vaina y extensión y protrusión del pene por si mismo, y por último, las estimulaciones rítmicas de la musculatura originan la eyaculación.

Predilución

La dilución del semen se lleva a cabo en dos partes. La primera incluye la predilución, con 3 ó 4 volúmenes de diluyente por cada volumen de semen. El diluyente utilizado debe calentarse en el mismo baño María, con objeto de mantener la temperatura del semen (de 35C a 37C) y de esta forma proporcionará lecitina y lipoproteínas para proteger a los espermatozoides de un choque por frío y sustancias nutritivas durante el proceso de evaluación.

Evaluación

La evaluación de la calidad seminal es una consideración importante en el procesamiento de semen. Un examen de calidad seminal debe incorporar tantas medidas útiles de características seminales como sea posible dentro de los límites prácticos, modificando los procedimientos según los propósitos de evaluación. Los análisis seminales de rutina son:

1. Examen macroscópico. Se evaluara directamente en el tubo colector inmediatamente después de recolectado el semen bajo las siguientes características:

• Consistencia. La consistencia del semen depende de la relación de contenido de sus dos constituyentes, espermatozoides y plasma seminal. El examen es un método rápido y simple, en el cual se puede estimar la concentración espermática.
• Apariencia. La apariencia de un eyaculado normal de toro es de color blanco cremoso. Cuando se observa de cerca se puede ver cierto movimiento. La capa cercana al tubo de vidrio puede tener una apariencia granular debido al movimiento de los espermatozoides. Las muestras con concentraciones bajas tienen una apariencia acuosa o menos opaca, una coloración rosácea es indicativa de la presencia de sangre.
• Volumen de eyaculado. El volumen puede medirse directamente con el uso de un tubo de recolección graduado o utilizando una pipeta calibrada. Las variaciones en el volumen obedecen principalmente a factores como la edad y condiciones del animal, frecuencia de recolección y destreza del operario. Los animales jóvenes y aquellos que se encuentran en condiciones precarias de salud y nutrición, producen eyaculados de poco volumen. En los bovinos el volumen de eyaculado oscila entre 5 y 15 ml.
• Ph. Los valores del pH son los resultantes de la neutralización entre reacciones glandulares de acción tampón y la concentración iónica del material procedente de las ampollas de Henle y el epidídimo. Si el pH del eyaculado es ácido esto no indica baja calidad, pero como la alta actividad espermática de la muestra produce ácido láctico como un producto de desecho del metabolismo, el espermatozoide puede morir si la acidosis no es neutralizada. Puesto que los espermatozoides descomponen la fructosa del semen en ácido láctico en condiciones anaerobias el pH del semen disminuye probablemente con el tiempo transcurrido entre la colección y la evaluación, por eso es conveniente diluir el semen tan rápido como sea posible después de la colección.

2. Examen microscópico. Inmediatamente después de obtenido el semen debe ser evaluado por medio de técnicas de laboratorio, con el propósito de determinar su calidad.

• Motilidad. Se expresa como el porcentaje de células móviles o vivas. Dichas células pueden moverse en cualquier dirección sin importar la velocidad con la que lo hagan. Existen parámetros de motilidad entre los que se incluyen:
  1. Motilidad Progresiva. Es el porcentaje de espermatozoides que se mueven en línea recta, hacia delante incluyendo velocidad, sin tomar en cuenta las células que se mueven lateralmente o en círculos; se determina al examinar una gota de semen observando las células de manera individual bajo un campo microscópico con un aumento de 40 ó 100X. Este parámetro esta correlacionado positivamente con tasa de fertilidad.
  2. Motilidad Masal. La motilidad masal u onda de movimiento es el sistema más simple y sencillo que se dispone para evaluar la motilidad del semen fresco. La estimación de dicha movilidad se efectúa sobre el fundamento del vigor, fuerza o potencia de la onda según si esta presente o no el mencionado movimiento; relativamente es una técnica subjetiva pero con la práctica s efectúa una estimación muy segura. Se determina al examinar una gota de semen sin diluir observando las ondas bajo un campo microscópico con un aumento de 10X.
• Porcentaje de espermatozoides vivos. Se ha utilizado la determinación del porcentaje de espermatozoides vivos en una muestra se semen como verificación de la motilidad y para el control de calidad del semen posdescongelado. La eosina se conoce como tinción diferencial, pues no puede atravesar la membrana de células vivas y sí la de células muertas. Una tinción de contraste, como la nigrosina, el azul de ópalo o el verde rápido, hacen visibles las cabezas no teñidas. Para su cuantificación se elaboran laminillas o frotis con una gota de semen diluido y teñido con algún colorante especial (ver anexo), colocándolos en una platina térmica a 37°C para fijar las células. Para el conteo se utiliza un microscopio con objetivo de 40 ó 100X.
• Morfología. La clasificación morfológica de los espermatozoides ha llegado a ser una parte integral e indispensable en los análisis de semen de todas las especies. La medición de este parámetro es una prueba de control de calidad, dado que si la proporción de espermatozoides anormales es muy alta el semen se considera de baja calidad. La presencia de más de 25% de anormalidades pueden ser asociadas con infertilidad, así mismo las muestras que contengan más de 15% no se deben usar para IA.

El examen morfológico puede alterarse debido a variables como el choque térmico, manejo inapropiado del semen, prolongada inactividad sexual y una exposición a frío o calor extremos durante el almacenamiento de espermatozoides en el epidídimo. En cuanto a la incidencia de anormalidades se consideran las de mayor frecuencia las siguientes: Cola enroscada (puede considerarse como anormalidad o puede ser causada por choque térmico debido al mal manejo de la muestra), cola en forma de gancho, cola doblada, y presencia de espermatozoides inmaduros (presencia de gota citoplasmática a cualquier nivel de la cola, lo que se atribuye a sobreutilización del animal). Menos frecuentes se mencionan defectos de la cabeza tales como macrocefalia, microcefalia, cabeza doble y desprendimiento de la misma; en el caso de la cola son poco frecuentes la presencia de cola acortada, cola doble y la ausencia de ésta. El estudio morfológico, permite distinguir los dos tipos de espermatozoides y expresar los resultados en porcentaje.

Para su cuantificación se utiliza la misma técnica que se mencionó en la determinación de porcentaje de espermatozoides vivos.

1. Anormalidades Primarias. Estas son de origen testicular. Se piensa que ocurrió una falla en el proceso de espermatogenesis y ésta no se corrigió mientras el espermatozoide pasaba por el sistema de conductos. El enrollamiento es la anormalidad más común de cola y de hecho del espermatozoide entero.
2. Anormalidades Secundarias. Aparecen durante el paso de los espermatozoides por el sistema de conductos, después de salir de los túbulos seminíferos.

• Concentración Espermática. La concentración espermática de un eyaculado es el producto de la suma de toda una serie de factores y es uno de los parámetros de mayor importancia que se debe de tomar en cuenta para procesar una muestra de semen con fines de IA. Entre los factores se puede mencionar el grado de preparación sexual del macho, edad, salud, estado nutricional, capacidad productora de espermatozoides, etc.

La concentración espermática se refiere al número de espermatozoides por mililitro de semen; y será determinada en cada muestra inmediatamente después de la colección. Se pueden utilizar dos técnicas:

La técnica hemocitómetro, la cual fue diseñada para contar eritrocitos. Consiste en una laminilla especial que tiene dos cámaras de conteo y dos pipetas para diferentes diluciones. Las cámaras de conteo tienen 0.1 mm de profundidad y una cuadricula graduada en el fondo con una área de 1 mm2, este cuadro se divide en 25 cuadros más pequeños. Enseguida se describe el procedimiento de uso de la pipeta de dilución y el hemocitómetro:

1. Dilución de 1:200. Se vierten en un vidrio de reloj cantidad necesaria de semen y solución de Hayem (ver apendice), a la que se puede agregar una pequeña gota de eosina. Se succiona semen hasta la marca graduada a 0.05 y solución de Hayem hasta 101. Se homogeniza la mezcla.
2. Preparación del Hemocitómetro. Se localiza la cuadricula de la cámara, se coloca la punta de la pipeta en el ángulo formado por el cubreobjetos y la cámara y se deposita cantidad necesaria de la dilución realizada anteriormente.
3. Conteo. Es necesario contar todas las células de 5 cuadros grandes en diagonal o las de las cuatro esquinas y el centro. Al sumar los espermatozoides es necesario incluir las que están tocando las líneas de los lados internos de la cuadricula. Los dos procedimientos anteriores se repiten para la segunda cámara.

Cálculo para determinar la Concentración Espermática por medio del Hemocitómetro:

• Se contaron los espermatozoides de un volumen de 1/50 mm3
• El semen se diluyó en proporción de 1:200
• El número de células contadas, multiplicado por la fracción de volumen estimada y por la tasa de dilución, es igual al número de células por mm3
• La concentración se expresa en ml, o bien en cm3, por lo tanto, multiplique el resultado anterior por 1,000 y así se obtiene el número total de células por ml de semen. Observe que el resultado final es equivalente al conteo inicial de espermatozoides por diez millones; por lo tanto nos podemos evitar el cálculo anterior y tomar como una constante fija.

[latex] x×50×200={10,000x}/{mm^3}[/latex]

• La concentración se expresa en ml, o bien en cm3, por lo tanto, multiplique el resultado anterior por 1,000 y así se obtiene el número total de células por ml de semen. Observe que el resultado final es equivalente al conteo inicial de espermatozoides por diez millones; por lo tanto nos podemos evitar el cálculo anterior y tomar como una constante fija.

La otra técnica es la del Espectrofotómetro, el procedimiento se basa en la absorción de luz que pasa a través de una serie de lentes y filtros de una muestra de semen diluido. La luz que pasa se mide con un galvanómetro. Existen varias marcas y modelos de estos instrumentos, pero se deben calibrar con una muestra de semen de concentración conocida determinada por la técnica del hemocitómetro, de manera que las lecturas se puedan convertir a concentraciones.

Cálculo del número de dosis.

Una vez determinada la evaluación se calcula el número de dosis con la siguiente formula:

[latex] {VE×CE×PMP×PN}/{CDP}[/latex]

Donde:

V = Volumen de eyaculado
CE = Concentración espermática
PMP = Motilidad Progresiva (expresada en porcentaje)
PN = Porcentaje de células normales.
CDP = Concentración deseada por pajilla.

A continuación se presenta un ejemplo:

Datos: VE = 5 ml, CE = 1800 millones de espermatozoides/ml, MP = 75%, Anormalidades = 10% y queremos una concentración por pajilla de 50 millones.

[latex] 5×1800×.75×.90/50=121.5 dosis o pajillas[/latex]

Dilución:
La dilución del semen se realiza por razones técnicas y biológicas: en las primeras el problema es reducir el número de espermatozoides a la dosis requerida, manteniendo un volumen adecuado, así esto se soluciona mediante la dilución. En las segundas, es la de proporcionar nutrientes a los espermatozoides, un sistema de amortiguador a los cambios de pH un ambiente isotónico, además de proteger de un choque térmico. Debido a que el plasma seminal brinda una limitada protección a los espermatozoides, en cuanto a los cambios de temperatura, acumulación de sustancias como (CO2), y se encuentra en una muy concentrada, se hace estrictamente necesario diluir el eyaculado utilizando compuestos especialmente formulados.

La dilución del semen puede ajustarse según los requerimientos específicos de volumen y número de espermatozoides requerido para la inseminación. Para realizar la dilución en una forma correcta se toman en cuenta los siguientes pasos:

1. Se determina la cantidad de diluyente que se va a utilizar de acuerdo al número de dosis o pajillas aplicando la formula anterior. Tomando como referencia el ejemplo anterior:

• 121 pajillas con un volumen de .5 ml (121 x .5) nos dará como resultado el Volumen Total (VT) requerido para 121 con una CE de 50 millones cada una = 60.5 ml
• El VT menos el volumen de eyaculado tendremos el volumen de diluyente

[latex] VT-VE=VOLUMEN DE DILUYENTE[/latex]

[latex]60.5-5=55.5ml[/latex]

2. Se agrega el 50% de la cantidad total del diluyente A (sin glicerol) y se mezcla bien con el volumen del eyaculado (El diluyente y el semen deben de estar a la misma temperatura (35 grados centígrados). Nota: se tendrá que restar la cantidad que se utilizó para la predilución.
3. Colocar el recipiente que contiene el semen diluido en baño María a 35C, meterlo en el refrigerador y esperar a que baje la temperatura paulatinamente hasta 5C, que tardará de una a dos horas aproximadamente.

Glicerado

La adición de glicerol al semen es un proceso que debe realizarse de manera gradual, ya que si se realiza con rapidez se destruye a los espermatozoides, por lo que se recomienda la adición de glicerol en forma paulatina, dividiendo la cantidad de diluyente con glicerol (diluyente B) en cuatro porciones (10, 20, 30 y 40% para un total de 100%) y agregando cada porción en intervalos de tiempo para minimizar los efectos deletéreos de las altas concentraciones de glicerol, realizando el proceso a una temperatura de 5°C.

Equilibramiento

El período de tiempo que transcurre entre la mezcla del crioprotector con la suspensión de células y el inicio del proceso de congelado es llamado equilibramiento. El propósito del equilibramiento es permitir la traslocación del agua y por tanto reducir los efectos dañinos de la nucleación del hielo intracelular durante el proceso de congelado y descongelado. Este es un período que varía según la especie, de igual forma la cantidad de glicerol que se adiciona al diluyente. En el bovino el tiempo óptimo de equilibramiento es de 2 a 6 horas con promedio de 4.

Segunda Evaluación

El semen en esta etapa se evalúa por motilidad progresiva con la finalidad de obtener la calidad y saber si tiene probabilidad de congelar.

Etiquetado de la Pajilla

Durante el tiempo en que el semen es preparado para su envasado y congelado, las pajillas son debidamente etiquetadas con la siguiente información:

• Nombre y registro del toro
• Clave del toro
• Raza
• Registro
• Institución que procesa el semen

Métodos de envasado para semen

El tamaño y forma de envasado tiene una importancia práctica dado que determina tanto el medio de identificación de cada dosis de semen y como ésta será acomodada para su almacenamiento en el contenedor de nitrógeno. Los métodos más comunes de envasado para semen bovino son las pajillas francesas de .5 ml, y minipajillas de .25 ml. Las pajillas necesitan poco espacio de almacenaje, son de bajo costo, su manejo es sencillo y se identifican fácilmente.

Sellado de la Pajilla

Existen varias formas de sellar las pajillas, una máquina especial de vacío que va llenando y al mismo tiempo sellando automáticamente otras como alcohol polivinilico, esferas de plástico y esferas metálicas.

Congelado

El congelamiento de semen en pajillas se realiza por suspensión en vapores de nitrógeno líquido. La velocidad de enfriamiento se regula por la distancia de las pajillas al nivel del nitrógeno líquido. La curva de enfriamiento es importante para el congelamiento de pajillas, obteniéndose los mejores resultados cuando la temperatura disminuye en forma de una parábola. Las condiciones mencionadas se consiguen al suspender las pajillas a una altura de entre 4 y 6 cm. sobre el espejo de nitrógeno líquido (-120°C), altura que ha demostrado ser idónea para congelamiento de pajillas de .5 ml y de 4 cm. para pajillas de .25 ml por un tiempo de 12 a 15 minutos.

Almacenamiento

Independientemente del método de envasado, el semen congelado se almacena sumergido en nitrógeno líquido (-196°C) en contenedores especiales de
diferentes capacidades, que se consiguen fácilmente de manera comercial. Los espermatozoides almacenados en nitrógeno líquido tienen su potencial fertilizante de manera prácticamente indefinida.

Descongelado

El procedimiento de descongelado de semen es tan importante como el congelamiento, esto se debe a que los espermatozoides que sobrevivan al almacenamiento a (-196°C) deben pasar dos veces por la zona crítica de temperatura, que se encuentra entre -15°C a -60°C. El descongelado de pajillas a una temperatura de 37C por 30 seg. provee excelentes resultados en cuanto a tasas de motilidad posdescongelado y fertilidad.

Control de calidad

Esta se lleva a cabo 48 horas después del congelado, mediante una evaluación microscópica con la finalidad de conocer si se tuvo éxito.